Výzkumný program 5 (VP5) se zaměřuje na proof-of-concept preklinické studie, které představují in vivo konfirmaci experimentálních léčebných strategií prováděnou obvykle na imunodeficientních myších nesoucích pacientské xenografty, a na časné studie fáze léčby (fáze 1/2) prováděné na pacientech. Jaké jsou hlavní dosažené výsledky v uplynulých letech?
Na programu VP5 participují Ústav patologické fyziologie 1. LF UK a I. interní klinika – hematologie 1. LF UK a VFN v Praze (prof. Klener), centrum BIOCEV 1. LF UK (doc. Havránek) a Fakultní Thomayerova nemocnice v Praze (doc. Boublíková). Spolupráce však probíhá napříč celým konsorciem NÚVR, příkladem může být vývoj a testování polymerně vázaných léčiv ve spolupráci s Ústavem makromolekulární chemie AV ČR (RNDr. Etrych). Níže přinášíme hlavní dosažené výsledky VP5.
Vytvoření databáze nových preklinických modelů jako platformy pro proof-of-concept preklinické studie (phase 2-like murine studies)
Díky podpoře NÚVR se nám podařilo významně rozšířit databázi nových preklinických modelů lymfoproliferací, včetně nehodgkinských lymfomů a akutních lymfoblastických leukémií. Naše databáze v současnosti obsahuje přes 30 nových buněčných linií a přes 60 nových PDX modelů (Jakša et al., Laboratory Investigation 2022). Na rozdíl od komerčně dostupných nádorových linií byly všechny námi odvozené linie validovány pomocí celoexomového sekvenování v přímém srovnání s primárními nádorovými buňkami, ze kterých byly linie odvozeny. Z tohoto důvodu nazýváme nově odvozené lymfomové a leukemické linie termínem patient-derived lymphoma cell lines (PDCL). Díky dostatečně široké databázi PDCL a PDX modelů se nám podařilo dokončit některé proof-of-concept in vivo studie, které mimikují studie fáze 2 na lidských subjektech, ale jsou provedeny na imunodeficientních myších nesoucích PDX či PDCL xenografty (phase 2-like proof-of-concept studies). Studie prováděné na imunodeficientních myších navíc umožňují i následný translační výzkum PDX tumorů, například po selhání testované léčby. Výsledky byly prezentovány na výročním kongresu americké společnosti pro hematologii ASH 2024 a publikace jsou buď odeslané k recenznímu řízení, či jsou v pokročilém stádiu přípravy (Kazanstsev et al. Blood 2024; Löber et al., Blood 2024).
Mutační a transkriptomová analýza lymfomů, klonální vývoj a studium adaptačních změn lymfomových buněk po selhání léčby
Jedním z klíčových projektů skupiny VP5 je mutační analýza lymfomů a adaptační mechanismy lymfomových buněk po selhání léčby, s cílem lépe pochopit molekulární mechanismy zodpovědné za selhání léčby a najít nové terapeutické cíle. Za největší úspěch považujeme publikaci věnovanou klonálnímu vývoji na základě dosud největšího souboru párových vzorků získaných od pacientů s lymfomem z plášťových buněk při diagnóze a při relapsu lymfomu po selhání léčby 1. linie založené na imunochemoterapii (Karolová et al., American Journal of Hematology 2023). Naše data z celoexomového sekvenování (WES) prokázala selekci lymfomových buněk s větším počtem genetických aberací, které se podílí na detekci genotoxického stresu (mutace TP53, delece CDKN2A).
V roce 2024 jsme se soustředili na studium genetických změn asociovaných s klinickým průběhem MCL. Pomocí celoexomového sekvenování jsme analyzovali vzorky pacientů, kteří buď nereagovali na léčbu, nebo prodělali časný relaps, a porovnali je se vzorky pacientů, kteří dosud relaps neprodělali, nebo prodělali relaps po minimálně 7 letech od zahájení léčby. Prokázali jsme signifikantně vyšší počet mutací a copy number aberací u pacientů s časným relapsem. Prokázali jsme, že některé mutace (např. NOTCH1/2, delece CDKN2A) se u pacientů s dlouhou remisí po léčbě nevyskytují a lze je detekovat pouze v kohortě pacientů s časným relapsem. Předběžné výsledky jsme prezentovali na výročním kongresu americké společnosti pro hematologii ASH 2024 (Karolová et al., Blood 2024).
V posledních dvou letech jsme zavedli analýzu lymfomových buněk pomocí jednobuněčného sekvenování (single cell RNA sequencing, scRNAseq). S využitím scRNAseq jsme analyzovali lymfomové buňky získané od pacientů s lymfomem před zahájením léčby a při časném relapsu po selhání imunochemoterapie. Již v diagnostických vzorcích jsme byli schopni detekovat malé procento lymfomových buněk (lymfomový subklon), které byly transkripčně identické s majoritní lymfomovou populací detekovanou při relapsu choroby. Naše výsledky tak naznačují přítomnost malého subklonu rezistentních lymfomových buněk již při diagnóze. Předběžné výsledky jsme prezentovali na ASH 2023 (Kazantsev et al., Blood 2023). Rukopis je v recenzním řízení.
Studium adaptačních mechanismů umožňujících přežití lymfomových buněk v hluboké hypoxii (1 % O2)
V rámci spolupráce mezi Ústavem patologické fyziologie 1. LF UK a centrem BIOCEV 1. LF UK jsme dokončili a publikovali komplexní charakterizaci lymfomových buněk adaptovaných na dlouhodobou hlubokou hypoxii (Daumova et al., Cell Death Discovery 2025). Naše data odhalila u lymfomových buněk adaptovaných na dlouhodobou hypoxii komplexní změny na úrovni transkriptomu, proteomu a metabolomu a odhalila nové potenciální cíle pro eliminaci adaptovaných buněk, včetně nových proapoptotických strategií (Dolníková et al, Blood Advances 2024), metabolických inhibitorů či inhibitorů PI3K-AKT dráhy (Bettazová et al., Blood Advances 2024).
Nové terapeutické přístupy k inhibici PI3K-AKT signální dráhy
PI3K-AKT signální dráha je patologicky hyperaktivovaná u mnoha typů nádorů, včetně lymfomů. Z tohoto důvodu bylo vyvinuto mnoho nízkomolekulárních inhibitorů zaměřených na různé úrovně této dráhy. Jejich účinnost je však snižována zpětnovazebnými mechanismy reaktivace dráhy a zatížena závažnými vedlejšími účinky. Vyvinuli jsme nový a vysoce efektivní terapeutický koncept, tzv. vertikální kombinační inhibice. Jedná se o simultánní inhibici jedné signální kaskády na čtyřech úrovních zároveň. Prokázali jsem, že vertikální inhibice PI3K-AKT signalizace je u lymfomů velmi účinná, zabrání kompenzatorní re-reaktivaci dráhy a je tolerována in vivo (Kupcova et al., Experimental Hematology and Oncology 2024). V roce 2024 jsme také dokončili studii, která ukázala nový terapeutický cíl PI3K-AKT signální dráhy: PDPK1 kinázu zodpovědnou mimo jiné za fosforylaci a aktivaci AKT. Její genetická eliminace byla univerzálně toxická u všech testovaných modelových linií lymfomů a zdá se, že výhodná by tak mohla být zejména její cílená degradace. Výsledky jsou letos prezentovány na prestižní mezinárodní konferenci maligních lymfomů ICML 2025 (Herman et al. Phosphoinositide dependent protein kinase 1 is a key metabolic regulator and potential therapeutic target in lymphoma) s následným brzkým odesláním k publikaci.
Studium využití cirkulující nádorové DNA pro diagnostiku a monitoraci lymfomů
Volná nebuněčná cirkulující nádorová DNA (ctDNA, circulating tumor DNA) by mohla být velmi dobrým nástrojem pro diagnostiku a sledování odpovědi na léčbu nádorů. Vyvinuli jsme proto specifický vlastní panel genů pro ctDNA sekvenování u lymfomů. Ve spolupráci s Oční klinikou a I. interní klinikou 1. LF UK a VFN jsme ukázali, že volná nádorová DNA je jednoznačnou budoucí metodou volby diagnostiky velmi vzácných vitreoretinálních lymfomů, u kterých je diagnostika jinak velmi svízelná. Analýza vzorků od 15 pacientů ukázala, že nádorová DNA je ve sklivci přítomna ve vysokých koncentracích. U všech pacientů jsme velmi spolehlivě detekovali lymfomově specifické mutace DNA. Výsledky byly prezentovány na ASH 2024 (Velasova et al., Blood 2024). Dále jsme potvrdili, že vstupní plazmatická koncentrace ctDNA je nezávislým prognostickým faktorem u pacientů s nejčastějším typem lymfomu a její pokles v průběhu léčby koreluje s přežitím a odpovědí na léčbu (ASH 2024, publikace v recenzním řízení). Přehled ctDNA problematiky jsme publikovali ve dvou souhrnných článcích (Maco et al., Annals of Hematology 2022; Hamova et al., Expert Review of Molecular Diagnostics 2025).
Studium deregulace signálních kaskád u lymfomů
Jednou ze signalizačních kaskád, která je aktivní u lymfomů a přispívá k nádorovému růstu, je signalizace z B buněčného receptoru (BCR). V rámci spolupráce jsme přispěli k objasnění dominantního mechanismu aktivace BCR signalizace u lymfomů formou tzv. na antigenu nezávislé autonomní BCR signalizace (Eken et al., Journal of Experimental Medicine 2024). V dalších studiích se specificky zabýváme rolí mutací v BCR koreceptorových molekulách CD79A/B (přehledový článek Tkachenko et al., International Journal of Molecular Sciences 2024), či novou rolí mutací EZH2 histone methyl transferázy (článek v recenzním řízení).
Translační výzkum testikulárních nádorů
Testikulární nádory jsou vzácné nádory patřící mezi tzv. orphan diagnózy, současně jsou to nejčastější solidní nádory mladých dospělých mužů a nejčastější příčina úmrtí na malignitu v této populaci. Na rozdíl od naprosté většiny ostatních malignit u nich nedošlo po dlouhá desetiletí k žádnému významnějšímu pokroku v léčbě, která se stále zakládá na chemoterapii na bázi cisplatiny a která u části pacientů selhává. U těchto tzv. platina-refrakterních pacientů jsme pomocí celoexomového sekvenování nádorových vzorků i cirkulující nádorové DNA identifikovali několik molekulárních aberací, které pravděpodobně souvisejí s progresí onemocnění a se vznikem rezistence na platinu, jejíž příčina zatím nebyla objasněna (manuskript v přípravě k publikaci). Navázali jsme širokou mezinárodní spolupráci v translačním výzkumu nádorů varlat a uspořádali v říjnu 2024 v Praze 10. Evropský Testikulární Workshop jako největší mezinárodní konferenci věnující se testikulárním nádorům, které se zúčastnila většina světových expertů v tomto oboru. Na základě usnesení workshopu zakládáme konsorcium European Testicular Tumor Network a podáváme žádost o jeho podporu v Evropském programu COST Action Call 2025.
Výhled do budoucnosti
Hlavní mise a výzvy programu VP5 zůstávají do značné míry stejné. Jedná se o další rozšiřování databáze nových preklinických modelů pro relevantní preklinický výzkum, testování inovativních léků a léčebných strategií na myších modelech a bližší poznání molekulárních mechanismů zodpovědných za selhání léčby (mechanismy látkové rezistence). Mezi další budoucí cíle patří další studie důsledků deregulace signálních kaskád či nádorově specifických mutací (BCR signalizace, PI3K-AKT signalizace, epigenetická regulace) a pokračující výzkum využití ctDNA pro diagnostiku a monitoraci lymfomů.
Pavel Klener, Ludmila Boublíková, hlavní vedoucí VP5